Родился 30 июня 1948 года в городе Меленки Владимирской области. Отец — летчик погранвойск, мать — бухгалтер. Детство провел в Эстонии. В 1972 году окончил Ленинградский механический институт по специальности «производство летательных аппаратов». Трудовую деятельность начал младшим научным сотрудником Института прикладной химии (Ленинград). В 1975-1977 годах служил в вооруженных силах. С 1977 года работал инженером, старшим инженером Госкомитета Совмина СССР по внешнеэкономическим связям (ГКЭС). Эта структура часто использовалась в качестве прикрытия для деятельности сотрудников Первого главного управления (внешняя разведка) КГБ СССР. Одновременно с господином Якуниным в ГКЭС трудился нынешний премьер Михаил Фрадков. В 1982-1985 годах Владимир Якунин работал начальником иностранного отдела Физико-технического института имени Иоффе АН СССР в Ленинграде. С 1985 года в Вене: второй, затем первый секретарь постпредства СССР при ООН, в комитете ООН по использованию космического пространства в мирных целях. По данным газет La Repubblica и «Русская мысль», был кадровым офицером разведки.
В апреле 1991 года вернулся в Санкт-Петербург и ушел в бизнес, занявшись привлечением иностранных инвестиций (с июня 1991 года председателем комитета по внешним связям мэрии города был Владимир Путин). В начале 90-х господин Якунин занимался созданием Международного центра делового сотрудничества и банка «Россия». По поручению городских властей входил в советы директоров Балтийского морского пароходства и отеля «Европа». В апреле 1997 года возглавил Северо-Западную окружную инспекцию Главного контрольного управления президента РФ (с марта 1997 года ГКУ возглавлял Владимир Путин). С 7 октября 2000 года — замминистра транспорта, отвечал за развитие торгового флота и деятельность морских портов. 8 февраля 2002 года назначен первым замминистра путей сообщения. Возглавлял совет директоров Транскредитбанка. 24 октября 2003 года утвержден первым вице-президентом ОАО «Российские железные дороги». В 2004 году назывался СМИ в списке кандидатов на посты руководителей администрации президента, министра транспорта и премьер-министра. 16 августа 2004 года возглавил совет директоров ЗАО «Компания "Транстелеком"».
Награжден медалью «За боевые заслуги» и орденом Святого равноапостольного князя Владимира 2-й степени. Член попечительского совета БДТ имени Товстоногова. Увлекается охотой, театром, ездой на автомобиле. По данным СМИ, вместе с Владимиром Путиным входит в состав учредителей дачного кооператива «Озеро» в Ленобласти. В молодости занимался плаванием, вольной борьбой, боксом. Женат, супруга занимается домашним хозяйством. Два сына — выпускники Санкт-Петербургского университета (экономист и юрист).