Конструирование коровы
исследования / генетика
Белок CRISPR/Cas9
Фото: VICTOR HABBICK VISIONS / SCIENCE P / VHB / Science
Биотехнология находится на пороге значительных изменений,.которые затронут и сельскохозяйственное животноводство.
Медленная генетика
Тысячи лет человечество совершенствовало породы и сорта животных и растений для своих нужд. Процесс шел медленно, многие сотни лет ушли на то, чтобы отобрать и закрепить у сельскохозяйственных животных желательные продуктивные признаки, получить коров, дающих много молока, кур, несущих много яиц, свиней с толстым слоем шпика. Процесс этот назывался селекцией и первоначально был направлен на отбор только на основании хозяйственных признаков (фенотипа).
В эпоху индустриализации сельского хозяйства появились требования к скорости набора живой массы скота, питательности его рациона, и с этой задачей аграрии справились. Из спектра существовавших пород были выбраны несколько базовых, собравших в себе наиболее значимые для индустрии признаки и ставших основой производственных стад.
С появлением и развитием генетики ее достижения активно внедрялись в сельское хозяйство: проводился отбор не только по фенотипу, но и по генотипу — в работу брались особи, еще не проявившие желательный фенотип, но имеющие нужные для этого варианты генов.
Сегодня сельскохозяйственное животное — это практически автомат, направленный на выполнение одной функции: набора живой массы, производства яиц, молока. Гибридизация базовых пород дает продуктивное поголовье для производственных ферм. Прирост и удой четко описываются в бизнес-планах, и все, что требуется,— соблюдение технологии производства. Конец истории?
Нет.
После того как был решен вопрос достаточного количества, встал вопрос качества. И тут, как и в других отраслях промышленности, оказалось, что индустриализация производства — "грязный" процесс. Антибиотики, гормоны, стимуляторы роста, удобрения, гербициды, обеззараживающие вещества, консерванты — все это необходимые элементы индустриального сельского хозяйства, и все это постепенно вытесняет его продукцию за рамки понятия "здоровое питание".
Но как повернуть вспять процесс селекции, который шел сотни и тысячи лет? Сейчас, чтобы перенести какой-то желаемый генетический признак из одной породы в другую (например, существует природная мутация в гене миостатина, которая делает бельгийскую голубую породу коров очень мясистой), никто не станет тратить 50 лет не скрещивание нескольких поколений крупный животных. Но и оставлять без внимания запрос на здоровую пищу нельзя. Самое простое решение — отказ от индустриального подхода — сразу взвинчивает цену продукта, создает риски инфекционной безопасности продуктов и снижает сроки их хранения.
Долгое время очевидного решения этой проблемы не было. Рос массив данных о генетике животных, выявлялись гены, отвечающие за проявления желаемых признаков, но скорость селекционного процесса по-прежнему не удовлетворяла бизнес-плану на три года. Генная инженерия до последнего времени просто не имела инструментов, которые бы могли заметно ускорить такой процесс, повысить его эффективность. И наконец такой инструмент появился.
Для генной терапии, которая подает такие надежды врачам по всему миру, требуется осторожное, всеобъемлющее и очень точное тестирование, назидательно пишут Брэдли и Косицки
Быстрая генетика
Сегодня бактериальный механизм защиты от вирусов — белок CRISPR/Cas9 все активнее входит в обиход в биомедицине и биотехнологии.
CRISPR/Cas9 позволяет вносить разрывы в ДНК. Такие разрыва могут быть и случайными, можно их вызвать химическими мутагенами или радиоактивным излучением. Случайные, химические или радиационные разрывы в ДНК — инструмент классической селекции, которым ускоряли изменчивость, чтобы было из чего выбрать "материал" для дальнейшей работы.
CRISPR/Cas9 делает разрезы в ДНК в строго определенном, запрограммированном месте. А в сочетании с синтезированной матрицей, которая "помогает" клетке залечить такой разрыв, мы имеем высокоэффективный инструмент для внесения желаемых мутаций в геном животных.
Появилась возможность переноса требуемых мутаций из одной породы в другую за одно поколение, без потери других признаков и необходимости большого числа обратных скрещиваний. Селекция, основанная на технологии геномного редактирования, ускорилась в десятки раз, а процесс закрепления признака требует не 50, а 5 лет.
В мире уже получены свиньи, коровы, козы, кролики с "бельгийской" мутацией в миостатине. На поток поставлено получение безрогих коров. Получены свиньи, устойчивые к вирусным инфекциям, ведутся работы по созданию свиней, органы которых можно будет использовать для трансплантации человеку.
Широкое применение генетических методов в животноводстве, и особенно CRISPR/Cas9 геномного редактирования, может стать основой рывка в развитии биотехнологии животноводства и перехода на отечественные современные технологии хозяйствования.
Генетические ножницы
Сегодня технологию геномного редактирования CRISPR/Cas9 по важности для биомедицины ставят в один ряд с технологией полимеразной цепной реакции. Связано это с тем, что совершенно неожиданно в руках исследователей оказался высокоэффективный программируемый инструмент для разрезания ДНК в строго определенном месте, который можно применять для редактирования генома клеток и даже целых организмов.
Исино Ёсидзуми
Фото: University of Illinois Board of Trustees
1987
Японский исследователь Исино Есидзуми обнаружил в геноме кишечной палочки структурно консервативные, но отличающиеся по нуклеотидной последовательности элементы. Большого резонанса это открытие тогда не получило. Но постепенно такие структуры были обнаружены в геномах многих, в том числе патогенных, микроорганизмов.
1993
Испанский исследователь Франсиско Мохика нашел у галофильных архей (живущих в очень соленой среде вроде Мертвого моря примитивных микроорганизмах без ядра и мембранных органелл) нечто похожее на последовательности, открытые Есидзуми в геноме кишечной палочки. Вероятно, именно Мохика стал автором аббревиатуры CRISPR — расшифровывается как clustered regularly interspaced short palindromic repeats.
Франсиско Мохика
Фото: CORTESÍA / NOTIMEX / AFP
2005
Развитие исследовательских методов биоинформатики и накопление данных о геномах позволило тому же Франсиско Мохике с коллегами определить, что в повторяющихся структурах в геноме бактерий закодированы участки геномов вирусов, к которым эти бактерии устойчивы. В случае кишечной палочки это были участки генома бактериофага P1. Бактериофаги воздействуют на геном бактерии, подавляя его функции.
Исследователи предположили, что обнаружена система адаптивного "иммунитета" бактерий. При исследовании механизма работы такой "иммунной системы" бактерий обнаружены белки, которые отвечают за уничтожение ДНК вируса, проникшего в клетку бактерии. Оказалось, что, используя РНК, наработанную с участков генома вируса, которые закодированы в ДНК бактерий, белки типа Cas9 узнают ДНК этого вируса, если он проник в клетку, и режут ее, не давая вирусу развиваться.
2013
Система была впервые применена для внесения разрывов в геном эукариот, в том числе растений и животных.
В декабре в журнале Cell, в частности, появился отчет о работе Геральда Шванка с соавторами, которым удалось с помощью этой системы скорректировать инвитро клетки кишечника, мышиные и человеческие, имевшие дефект, вызывавший муковисцидоз.
Это был выдающийся успех. Долгие годы разрабатывались различные способы внесения таких разрывов в ДНК, что очень важно для генной инженерии на живых клетках. Но все существовавшие до этого системы (нуклеазы типа цинковых пальцев и TALEN-нуклеазы) были основаны на прямом узнавании "белок — ДНК", эти белки были очень громоздкими, "программирование" нуклеаз требовало значительных биоинформатических расчетов и кропотливой работы для создания "ножниц", которые из-за больших размеров было сложно доставлять в клетки.
Оказалось, что белок CRISPR/Cas9 не имеет таких недостатков.
Сам белок Cas9 достаточно компактный, а программирование состоит в подборе специфической РНК, которую можно легко синтезировать в лаборатории. Сегодня на CRISPR/Cas9 возлагаются большие надежды, эту систему уже пытаются адаптировать для генной терапии человека.
Так за 30 лет пройден путь от непонятных повторов в геноме бактерий до перспективного инструмента генной терапии человека.
Незаметно, поэтому опасно
Радость от того, что исследователи, а затем и практики получили генетические ножницы CRISPR-Cas9 — инструмент, с помощью которого можно редактировать геном, а значит, в скором будущем начать лечить генетические заболевания и корректировать свойства сельскохозяйственных животных,— надо бы поумерить. Такой вывод делает группа исследователей из института Wellcome Sanger в статье, опубликованной в журнале Nature Biotechnology в середине августа.
Этот институт финансируется из Wellcome Trust, благотворительного фонда биомедицинских исследований,— его создал сэр Генри Уэлкам, знаменитый бизнесмен, основатель лекарственной компании Wellcome, которая теперь находится в составе одной из крупнейших фармацевтических корпораций мира — GlaxoSmithKlein. Второе имя институт получил в честь Фредерика Сенгера, британского биохимика, единственного дважды лауреата Нобелевской премии по химии: за определение структуры инсулина и за метод секвенирования ДНК.
Авторы исследования Алан Брэдли и Майкл Косицки считают, что сделали первую систематическую оценку событий, которые следуют за редактированием генома с помощью "ножниц" CRISPR-Cas9. По их мнению, результаты вмешательства могут иметь неожиданные последствия, потому что значимость воздействия "ножниц" серьезно занижалась, а потому технологии CRISPR-Cas9 нужно применять с максимальной осторожностью и очень внимательно наблюдать за всеми изменениями, вызванными вмешательством.
Первым неладное заметил Майкл Косицки: он экспериментировал с "ножницами" и вдруг понял, что его манипуляции сказываются и на других частях генома, а когда осознал масштаб бедствия, предложил изучить вопрос подробнее.
Повреждения, которые наносят геному "ножницы", серьезней, чем считалось раньше, объясняют авторы исследования, но обнаружить это генетикам не удавалось, потому что стандартные тесты, отслеживающие изменения в редактированной ДНК, не "видят" нанесенного CRISPR-Cas9 генетического ущерба. Для генной терапии, которая подает такие надежды врачам по всему миру, требуется осторожное, всеобъемлющее и очень точное тестирование, назидательно пишут Брэдли и Косицки.
Действительно, появление генетических ножниц породило множество радужных ожиданий: CRISPR-Cas9 рассматривается как перспективный инструмент для лечения таких неодолимых пока заболеваний, как вирус иммунодефицита человека, рак или серповидноклеточная анемия. Генно-терапевтическими методами, надеется множество исследователей, можно будет инактивировать ген, вызывающий заболевание, или исправить генетическую мутацию.
Предыдущие исследования не показывали, что воздействие CRISPR-Cas9 приводит к множеству незапланированных мутаций. Брэдли и Косицки показали, что и в мышиных, и в человеческих клетках после вмешательства CRISPR-Cas9 нередко выявляются обширные изменения, причем на большом удалении от целевого места воздействия. Речь идет о значительных делециях ДНК, вставках фрагментов и перегруппировках ее участков. Возможно, все эти изменения ведут к включению или выключению каких-то генов, а о последствиях этого не хочется даже и задумываться.
Профессор Мария Ясин, исследователь из Мемориального онкологического центра имени Слоуна-Кеттеринга (Нью-Йорк), не участвовавшая в работе Брэдли и Косицки, высоко оценила результаты коллег, впервые исследовавших истинный размер повреждения генома при воздействии CRISPR-Cas9, и заметила, что, прежде чем браться за практическое использование "ножниц", стоит провести дополнительные исследования.
Для генной терапии, которая подает такие надежды врачам по всему миру, требуется осторожное, всеобъемлющее и очень точное тестирование, назидательно пишут Брэдли и Косицки