Развитие молекулярной биологии и биотехнологий позволило создать множество биосенсоров и тестов для диагностики — от быстрых анализов на COVID-19 до экспресс-тестов на патогены, поражающие сельскохозяйственные растения. Ученые из федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН создали платформу DIRECT2, которая может дать начало экспресс-тестам нового поколения на основе системы CRISPR-Cas12, и продемонстрировали ее работу на образцах с ДНК Dickeya solani — бактерии, которая поражает сельскохозяйственные растения. Принципы работы новой платформы и ее сравнение с другими методами биотехнологи изложили в журнале Biosensors and Bioelectronics.
Фото: Анатолий Жданов, Коммерсантъ
Фото: Анатолий Жданов, Коммерсантъ
Системы из генного участка CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), накопителя информации о ранее встреченных вирусах, и белка-нуклеазы семейства Cas (CRISPR associated protein) обеспечивают иммунитет бактерий, защищая от повторного заражения теми же вирусами. Программируемость этих систем и высокая специфичность распознавания генетической мишени позволяют использовать их в разработках по редактированию геномов. А в последние годы системы CRISPR-Cas начали применять и в биосенсорах, с высокой чувствительностью распознающих определенные последовательности ДНК или РНК. Российские ученые создали новую платформу, сочетающую технологию CRISPR-Cas, универсальный ДНК-белковый зонд и мембранный экспресс-тест, которая обеспечивает высокую достоверность бесприборной диагностики.
Белок Cas12 в комплексе с гидовой РНК распознает ДНК-мишень в пробе, сверяя ее последовательность с гидовой РНК — аналогично тому, как в бактериальной клетке проводится сверка с данными о ранее встреченных вирусах. Затем комплекс CRISPR-Cas12 разрезает ДНК-мишень и приобретает способность многократно расщеплять любые одноцепочечные ДНК. Используя одноцепочечные ДНК с присоединенной меткой (ДНК-зонд), можно регистрировать высвобождение этой метки, например, с помощью мембранного теста. При этом окраска тестовой линии появляется при наличии в пробе целевой ДНК, а для отрицательных проб отсутствует. Все тестирование протекает без сложного оборудования и с минимальными действиями оператора, что позволяет его проводить во внелабораторных условиях. Однако в ранее предлагавшихся разработках нерасщепленный ДНК-зонд также связывался тестом, что могло искажать результаты анализа.
Для преодоления этой трудности авторы работы создали биосенсор, в котором на носителе закреплен зонд, состоящий из ДНК-части (одноцепочечной ДНК с функциональной группой — гаптеном) и белковой части (мышиные антитела против гаптена). Активированный ДНК-мишенью белок Cas12 разрезает зонд. Высвобожденная конструкция детектируется иммунохроматографическими тест-полосками благодаря специфическому связыванию антитела с антимышиными антителами, расположенными на мембране и на поверхности золотых наночастиц. Платформа получила название DIRECT2 (сокращенно от DNA-Immunoglobulin Reporter Endonuclease Cleavage Test).
Борис Дзантиев, доктор химических наук, заведующий лабораторией иммунобиохимии федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН:
— Современные молекулярные методы диагностики перешагнули рубеж главенствования ПЦР-тестирования как единственного высокочувствительного инструмента. Биотехнология создает новые подходы, значительно сокращающие время тестирования и позволяющие выявлять единичные вирусы и бактерии в пробе. И, что еще важнее, диагностика становится доступной для проведения непосредственно у кровати больного, в кабинете врача или в любом ином месте, не являющемся оборудованной лабораторией. Экспресс-тесты становятся надежной альтернативой лабораторной диагностике благодаря таким новым технологиям, как изотермические амплификации, система CRISPR-Cas точного распознавания ДНК/РНК-мишеней.
DIRECT2 — первая в России технология, использующая для диагностики высокочувствительную и специфичную систему CRISPR-Cas. Параллельно с публикацией наших результатов вышла статья китайских коллег в журнале Angewandte Chemie International Edition, также предлагающая надежную детекцию продуктов реакции CRISPR-Cas12 с помощью тест-полоски. На сегодняшний день именно эти работы — начало нового поколения экспресс-тестов с системами CRISPR-Cas.
Платформа является гибкой системой, ее можно изменять и развивать в зависимости от решаемой задачи, адаптируя ее для распознавания самых разных патогенов. Кроме того, полезным будет рассмотрение других носителей и компонентов композитного зонда.
Ирина Сафенкова, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории иммунобиохимии федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН:
— Для пользователя положительный результат экспресс-теста с CRISPR-Cas12 выглядит как появление двух линий (тестовой, Т-зона, и контрольной, K-зона) на тест-полоске. Возможность увидеть эти линии обеспечивают окрашенные наночастицы. Но «начинка» теста, молекулярные процессы и надежность получаемого результата совершенно разные у платформы DIRECT2 и тестов, использовавшихся раньше.
Обычный экспресс-тест с CRISPR-Cas12 работает по следующей схеме: тест-полоска ловит целый ДНК-зонд и наночастицы в K-зоне и не пропускает наночастицы в Т-зону. ДНК-мишень активирует Cas12, что приводит к разрезанию ДНК-зонда. Разрезанный ДНК-зонд является пропуском для наночастиц в T-зону. Серьезным недостатком этой схемы является риск получения ложноположительного результата. Наночастицы могут быть пропущены в T-зону под действием самых разных факторов, нет однозначной связи между разрезанием ДНК-зонда и окрашиванием Т-зоны. В платформе DIRECT2 без разрезания ДНК-зонда невозможно появление и связывание наночастиц в Т-зоне, приводящее к ее окрашиванию. Такая схема обеспечивает высокую надежность тестирования.
Набор для проведения DIRECT2-анализа включает реакционную смесь и два компонента. Первый компонент — это композитный зонд ДНК-белок, закрепленный на носителе — в лунках микропланшета или на магнитных частицах. При разрезании зонда его белковая часть высвобождается. Второй компонент — это тест-полоска, детектирующая белковую часть зонда. Т-зона окрашивается при разрезании ДНК-зонда активированным Cas12. К-зона окрашивается всегда, независимо от состава пробы.