В лаборатории физики белка Института белка РАН обнаружены и исследованы парадоксальные белки-антифризы, которые помогают животным, растениям и бактериям выживать при отрицательных температурах до -30°С. Физический принцип их действия продолжает исследоваться, но с большой вероятностью эти белки экранируют поверхности мембран в клетке, препятствуя возникновению на них центров кристаллизации льда.
Гусеница еловой листовертки-почкоеда Choristoneura. В ранних возрастах гусеницы минируют хвою и листья, то есть прогрызают в них ходы; в старших возрастах оплетают паутинкой хвою и листовую пластинку и скручивают ее в трубку, вызывая их полное усыхание. Зимуют в опавшей хвое, выдерживая морозы до -30°С. Именно ее рекомбинантный белок-антифриз исследовался в экспериментах в Институте белка РАН
Фото: Jerald E. Dewey, USDA Forest Service, United States
Гусеница еловой листовертки-почкоеда Choristoneura. В ранних возрастах гусеницы минируют хвою и листья, то есть прогрызают в них ходы; в старших возрастах оплетают паутинкой хвою и листовую пластинку и скручивают ее в трубку, вызывая их полное усыхание. Зимуют в опавшей хвое, выдерживая морозы до -30°С. Именно ее рекомбинантный белок-антифриз исследовался в экспериментах в Институте белка РАН
Фото: Jerald E. Dewey, USDA Forest Service, United States
Природные и искусственные антифризы
Экспрессируемые в холоднокровных организмах белки-антифризы, которые мешают образованию льда в их телах и тем самым помогают им выживать даже при экстремально низких температурах, были открыты в 1950-х годах и с тех пор довольно хорошо изучены. Однако до конца механизм действия этих белков все еще непонятен. Во всяком случае, он не сводится просто к понижению температуры сосуществования льда и воды.
В лаборатории физики белка Института белка РАН, исследуя ледсвязывающий белок (мутантную форму белка-антифриза cfAFP из гусеницы Choristoneura fumiferana, зимующей в хвое), мы обнаружили, что этот белок-антифриз вовсе не понижает температуру замерзания воды и, как ни парадоксально, даже повышает температуру плавления льда. Прежде чем перейти к объяснению этого парадокса, наверное, полезно будет вспомнить о том, как работают вещества, которые обычно используются в качестве природных и искусственных антифризов.
Например, чтобы спирт понизил температуру замерзания воды до -30°С, его нужно добавить почти 50%, то есть соотношение молекул спирта и воды должно быть приблизительно один к одному. Такое соотношение необходимо, чтобы молекулы спирта нарушили связи между молекулами воды и не давали им соединиться в структуру льда. В таких же больших концентрациях используют соли, глицерины и другие вещества, понижающие температуру замерзания воды.
Краткая биография белков-антифризов
Первая гипотеза о существовании белков-антифризов была сформулирована в работе Пера Шоландера из Института океанографии Скриппса (Freezing resistance in some northern fishes. Biol. Bull. Woods Hole, Mass., 1962). Им и его сотрудниками в крови скорпен и трески у побережья Лабрадора было отмечено «возникновение небольших степеней переохлаждения и присутствие в крови органических соединений антифриза», но идентифицировать его тогда не удалось. Более того, считалось, что оно относится «к небелковой азотной фракции. Нет никаких доказательств того, что это аминокислота, амин или оксид амина». Другой кандидат на роль природного антифриза тоже не был тогда идентифицирован: «По-видимому, он не содержит ни азота, ни фосфора, не является глицерином или родственным спиртом и, вероятно, не является восстанавливающим или невосстанавливающим сахаром, альдегидом или кетоном, карбоновой кислотой (липидной или другой), сложным эфиром или ароматическим соединением».
Тем не менее начало было положено, и к началу 1970-х годов белки-антифризы были обнаружены в крови рыб, обитающих в арктических и антарктических водах, где температура падает до -2°С. Состав этих белков отличается в зависимости от организмов, но сходен тем, что все белки-антифризы богаты остатками треонина и серина, которые формируют поверхность, способную связываться с поверхностью льда.
В ранних работах предполагалось, что белки-антифризы, или лед-связывающие белки, снижают температуру замерзания жидкостей организма на несколько градусов. Позднее стала преобладать точка зрения о том, что белки-антифризы спасают клетки от повреждений кристаллами льда, поскольку связываются с кристаллами льда и предотвращают их рост или влияют на форму кристаллов льда при повторяющихся циклах замерзания–оттаивания. (DeVries A.L. (1974) Survival at freezing temperatures. Biochem. Biophys. Perspect. Mar. Biol., 289–330).
С тех пор в большинстве работ критерием функциональной активности белков-антифризов является так называемый температурный гистерезис. Немного неудачный с точки зрения физика термин, которым назвали разницу между температурами сосуществования льда и воды в присутствии белка-антифриза и без него. Важно не путать температуру замерзания воды (температура в момент возникновения зародыша льда) и температуру сосуществования льда и воды (температура смеси).
В последнее время появляются работы, в которых белки-антифризы успешно используют при криоконсервации клеток и органов, предназначенных для трансплантации. Присутствие белков-антифризов безвредно, при их использовании увеличивается выживаемость клеток, уменьшается вероятность аномального развития клеток после криоконсервации. ((Ekpo MD, et al. (2022) Antifreeze Proteins: Novel Applications and Navigation towards Their Clinical Application in Cryobanking. Int J Mol Sci. 23(5):2639.)
Привлекают белки-антифризы и производителей замороженных полуфабрикатов, в первую очередь биологической совместимостью, в отличие от традиционных синтетических антифризов, применяющихся, например, для защиты двигателей автомобилей. Правда, на этом пути использования белков-антифризов маячит уже ставшее традиционным для народа опасение ГМО.
Неужели белки-антифризы работают в таких же больших концентрациях, нарушая связи между молекулами воды? Вряд ли! Жидкий «бульон» из молекул белка никому не нужен, ни нам для биотехнологий, ни клеткам для выживания в холодных условиях. В клетках, в которых обнаружены эти белки, соотношение белка-антифриза и молекул воды приблизительно 1:400 000. Это вполне приемлемая концентрация для белка, в том смысле, что такое количество белка клетка вполне способна синтезировать при подготовке «к зиме» и потом утилизировать при подготовке «к лету». Но как же тогда белки-антифризы могут работать в таких низких концентрациях? Каким образом одна молекула белка может повлиять на 400 тыс. молекул воды, чтобы всем им «запретить» замерзать? Такое априори невозможно!
Алексей Финкельштейн, доктор физико-математических наук, член-корреспондент РАН, выполнил теоретические расчеты, основанные на теории кристаллизации, которые показывают, что при температурах 0°…–30°C лед может возникать только на контактирующих с водой стенках (особенно «рифленых»), но никак не в толще воды. Эти расчеты и дополнительные эксперименты с белком-антифризом позволяют понять физический базис явления.
Две стратегии «антифриза» живой клетки. Первая стратегия — синтезировать сахара и спирты, которые понизят температуру замерзания воды. Хороша в тех случаях, когда переохлаждение небольшое или клетка может долго готовиться к зиме и потом долго выходить из «законсервированного» состояния.
Вторая стратегия — использовать белки-антифризы. Хороша в тех случаях, когда нужно пережить экстремально низкие температуры или клетке нужно быстро восстановиться и функционировать после переохлаждения.
Смешать, но не взбалтывать!
Из школьных учебников физики мы знаем, что вода замерзает при нуле градусов Цельсия. Действительно, лужи зимой замерзают достаточно быстро, чуть только подморозит. Но если налить в стакан очень чистую воду и поставили ее в морозильную камеру, в которой минус пять градусов, что произойдет? Правильно, ничего! Чистая вода замечательно существует в переохлажденном состоянии.
Если перефразировать Джеймса Бонда, тут главное смешать, но не взбалтывать (классическая формула заказа Бонда барменам: «Shaken, not stirred», то есть «Взболтать, но не смешивать».— Ред.). Так и здесь, чтобы образовался лед, переохлажденную воду нужно встряхнуть или бросить в нее что-то. В интернете можно найти множество видео, где переохлажденную воду резко встряхивают или бросают в нее ледышку и тем самым запускают процесс образования льда.
Для старта замерзания воды должен появиться первый зародыш льда — небольшая группа молекул воды, которая повернута в пространстве «правильным» льдоподобным образом. Образовать такую льдоподобную группу молекул в толще воды очень сложно, ведь молекулы постоянно движутся и вращаются. Именно поэтому чистая вода может оставаться жидкой вплоть до очень низких температур.
Совсем другая ситуация на поверхности твердого вещества. На твердой поверхности образовать слой неподвижных, «правильно» ориентированных молекул воды гораздо легче, и, соответственно, больше шансов, что такая группа молекул воды превратится в зародыш льда и запустит кристаллизацию воды. Конечно, не всякая твердая поверхность может помочь в образовании зародыша льда, но в природе таких поверхностей хватает, поэтому лужи зимой замерзают достаточно быстро.
Как работает белок-антифриз. Теоретические исследования с использованием молекулярной динамики показали, что аминокислотные остатки треонинов, расположенные на одной из сторон лед-связывающего белка двумя «стройными рядами», способны прочно связываться с кристаллической решеткой льда.
Структура лед-связывающего белка представляет собой трехгранную призму, на одной из граней которой расположены два ряда треонинов (показаны красным цветом). Аминокислота треонин встречается во всех природных белках. Предполагается, что именно треонины «ответственны» за связывание со льдом.
Белок-изолятор
Если вышеописанные рассуждения подкрепить теоретическими расчетами и экспериментами, можно прийти к двум простым выводам: (1) вода сама, без зародыша льда, «не хочет» замерзать вплоть до очень низких температур; (2) зародыш льда, при температурах от 0 до -20°С, образуется только на твердых поверхностях, желательно рифленых.
Тут, конечно, можно порассуждать о вероятностях. Понятно, что зародыш льда может образоваться при любой температуре и даже без твердой поверхности, вопрос только в том, как долго ждать этого события. Для этого и нужны были теоретические расчеты, из которых следует, что зародыш льда в чистой воде, при температурах до -20°С, не сможет образоваться без твердой поверхности, даже за несколько лет, не говоря уже о зиме или нескольких часах во время ночных заморозков.
Зная эти факты, можно предположить стратегию выживания организмов при низких температурах, без использования антифризов типа спиртов, сахаров и ароматизаторов.
Выходит, если вода может долго существовать в жидком, переохлажденном состоянии вплоть до -20оС, то все, что нужно — это найти внутри клеток твердые поверхности, на которых могут возникнуть зародыши льда, и заблокировать их. Белки для такой задачи подходят как нельзя лучше. Сейчас известно множество белков, основная функция которых «хватать» разные вещества. Поэтому способность белков-антифризов связываться с поверхностями, способными стать зародышами льда, не является чем-то сверхудивительным. Ведь именно кристаллики льда, которые могут возникнуть в клетке, опасны тем, что они протыкают клеточную стенку, и клетка гибнет. Без кристаллов льда само по себе понижение температуры для клетки совершенно безвредно.
Кстати, легко можно догадаться, какая твердая поверхность является самой хорошей для образования зародыша льда — конечно же, это поверхность самого льда. Поэтому свойство белков-антифризов связываться с поверхностью льда было обнаружено первым. При этом показано, что присутствие белков-антифризов замедляет рост кристалликов льда, если уж они образовались.
Полученные нами факты позволяют по-новому взглянуть на роль белков-антифризов. Они не понижают температуру замерзания воды, как обычные антифризы. Белки-антифризы находят поверхности, на которых могут возникнуть зародыши льда, прилипают к ним, блокируют возникновение зародышей льда и тем самым понижают вероятность запуска кристаллизации воды, то есть удерживают воду в жидком переохлажденном состоянии.
Для бактерий или насекомых это замечательная стратегия, чтобы переждать временное похолодание.