Считается, что гемофилия — проблема вырождающихся царских династий, но это вообще не так. Это просто редкое заболевание: на десять тысяч новорожденных мальчиков выпадает один случай. То есть каждый год в России рождается 50 детей, которым требуется лечение от гемофилии. Как болезнь вовремя распознать и можно ли ее вылечить, рассказывает Ольга Митяева, кандидат биологических наук, заведующая лабораторией геномного редактирования МФТИ, заместитель директора Центра живых систем МФТИ.
Теоретически мутация, ведущая к заболеванию, может появиться у ребенка от здоровых родителей, не являющихся ее носителями, однако это крайне редкое событие
Фото: Предоставлено пресс-службой МФТИ
Теоретически мутация, ведущая к заболеванию, может появиться у ребенка от здоровых родителей, не являющихся ее носителями, однако это крайне редкое событие
Фото: Предоставлено пресс-службой МФТИ
Гемофилия — заболевание, которое ведет к нарушению гемостаза — способности организма сохранять кровь в жидком состоянии, останавливать кровотечения при повреждении сосудов, растворять тромбы, когда стенка сосуда восстановлена.
Достается по наследству
Гемофилия — классическое наследственное заболевание. Случается оно вследствие мутации определенного гена, что в свою очередь ведет к отсутствию либо к нарушению функциональности белка, который кодируется этим геном. Практически всегда у болеющих гемофилией есть четко прослеживаемая семейная история. Теоретически мутация, ведущая к заболеванию, может появиться у ребенка от здоровых родителей, не являющихся носителями данной мутации, однако это крайне редкое событие.
Поскольку гены, связанные с гемофилией, кодируются на Х-хромосоме, то болеют, как правило, мальчики. У них две хромосомы — Х и Y, и, если мутация произошла на Х-хромосоме, компенсации от другой хромосомы нет, и у мальчиков при наследовании этого гена случается гемофилия.
Однако и девочки могут болеть, но очень редко. Такое может случиться, если ребенок рожден от отца, болеющего гемофилией, и матери, носительницы мутации. Всего в мире описано около 60 подобных случаев. Но в основном девочка не болеет — она становится носителем.
Когда мы получаем ранение, нарушается целостность сосудистой стенки. В этом случае организм принимает меры: эндотелий сосудов (тонкий внутренний слой поверхности сосуда) начинает выделять ряд сигнальных молекул, под воздействием которых тромбоциты скапливаются в месте разрыва, образуя первичную пробку и уменьшая кровопотерю. Это так называемый первичный, или клеточный, гемостаз. В ходе вторичного, или плазменного, гемостаза в дело вступает ряд факторов свертываемости крови, которые содержатся в плазме. Всего факторов свертываемости у человека «чертова дюжина» — 13.
Когда кровь не останавливается
Факторы свертываемости последовательно взаимодействуют, активируя друг друга. Они инициализируют превращение фибриногена в фибриновые волокна, которые составляют полимерную сеточку, укрепляющую эту пробку из тромбов, и образует плотную структуру, которая закрывает нарушение сосудистой стенки. Дальше рана заживает, и после этого этот тромб растворяется в кровотоке за ненадобностью.
Факторы свертываемости кодируются нашим организмом в геноме. Мутации в генах, кодирующих факторы крови, могут приводить к нарушениям работы системы гемостаза, причем это может быть как повышенное тромбообразование, так и, наоборот, снижение способности организма к остановке кровотечений. Нарушение всего лишь трех факторов свертываемости ведет к развитию гемофилии.
Гемофилия А — нарушение восьмого фактора свертываемости. В случае гемофилии В страдает девятый фактор. В случае наиболее редкой гемофилии С нарушается одиннадцатый фактор. В худших случаях этот фактор вообще отсутствует. Нарушается каскад реакций, и, как следствие, даже после небольших ранений, ушибов нарушается процесс свертываемости крови. Она просто не останавливается. Для человека с гемофилией даже небольшая царапина или синяк может стать фатальным.
Доставить нужный фактор
В зависимости от конкретной мутации проявления гемофилии могут быть разные — от небольших нарушений в свертываемости, когда кровь останавливается чуть медленнее, чем обычно, до ситуации, когда без внешних воздействий, без лекарственной фармподдержки кровотечение остановить нельзя, и человек умирает. Причем кровотечение может быть как внешним, так и внутренним. Бывает, молодой человек ничего не заметил и никаких внешних повреждений нет, но развивается внутреннее кровотечение, которое остановить еще сложнее, чем внешнее.
Редактирование человека
Понятно, что, какой бы современной и инновационной терапия ни была, мы воздействуем на уже состоявшееся заболевание. Возникает закономерный вопрос: а нельзя ли что-то сделать до того, как человек заболел?
Тут, к сожалению или к счастью, ответ отрицательный. Чтобы ребенок не родился с мутациями в геноме, единственный подход — редактирование генома нерожденного человека, что имеет массу вопросов. Насколько это безопасно, насколько этично?
Однако семьи с историей подобных заболеваний могут свести к минимуму вероятность рождения больного ребенка. Современные методы молекулярно-генетической диагностики позволяют выявлять мутации у эмбрионов на самой ранней стадии развития — когда эмбрион представляет собой несколько десятков клеток. Это называется предымплантационной диагностикой при проведении процедуры ЭКО. В результате для подсадки матери выбираются только здоровые эмбрионы — у нее рождается здоровый ребенок. Это реально и возможно уже сегодня.
Полностью вылечить гемофилию нельзя — можно только поддерживать человека в более или менее стабильном состоянии. Логика простая: если в организме не хватает фактора свертываемости, значит, его надо туда доставить. И пациенты для поддержания необходимого уровня свертываемости просто получают регулярные инъекции этого фактора в виде белка. В зависимости от тяжести это может быть два раза в неделю, реже или чаще. Но это должны быть постоянные инъекции в течение всей жизни. Это так называемая заместительная терапия — пациент регулярно получает тот белок, который он сам не умеет производить, но он ему жизненно необходим.
В нашей лаборатории в разработке лекарства от гемофилии используется принципиально другой подход. Мы разрабатываем генотерапию. В нашем случае это доставка в организм здоровой копии гена. Мы решили: если нет гена, который кодирует здоровый белок, давайте доставим этот здоровый ген, с которого будет постоянно экспрессироваться здоровый белок.
Вектор для генотерапии
Но как доставить здоровый ген в организм, а именно в печень пациента? Наиболее перспективный подход к доставке генетического материала пациенту — это использование аденоассоциированных вирусных векторов, в которые пакуется здоровый ген и индуцируется пациенту.
Что представляет собой вирус? Это генетический материал, необходимый вирусу для саморепликации в клетке, которую он заразил. Окружающий вирус капсид выполняет две основные функции — защищает генетический материал внутри себя от внешних воздействий, а также обеспечивает заражение клетки — доставку вирусных генов в клетку организма.
Когда мы слышим слово «вирус», да еще «заражает», то часто пугаемся. Но сегодня ученые научились использовать вирусы себе во благо — в частности, превращать их в инструмент доставки генов в организм. Это и есть вирусные векторы. Для этого вместо генетического материала вируса в вирусный капсид нужно упаковать нужные нам гены. В случае с разрабатываемой нами генотерапией гемофилии В мы пакуем ген девятого фактора свертываемости в аденоассоциированный вирусный вектор.
Этот спасительный аденовирус…
У аденоассоциированных вирусных векторов как систем доставки для генотерапий есть несколько существенных плюсов. Они обладают низкой иммуногенностью, способны трансдуцировать (или заражать) широкий спектр различных клеточных типов и тканей. Аденоассоциированный вирус неспособен самостоятельно встраиваться в геном человека, что понижает вероятность мутаций, опосредованных терапией, «встроек» не в то место. При транспортировке аденоассоциированным вирусным вектором доставляемая ДНК формирует так называемую эписому в ядре клетки — это небольшая кольцевая ДНК, которая находится вне ядерной хромосомы.
У человека 46 хромосом, и весь наш генетический материал упакован в хромосомы, а доставляемый аденоассоциированным вирусным вектором материал формирует в ядре клетки кольцевую ДНК, которая достаточно долго может там находиться, и с нее стабильно экспрессируется нужный белок. Соответственно, если клетка не делится, то эписома долго находится в этой клетке. Теоретически это время неограниченно — годы и даже десятки лет. Так мы получаем стабильный эффект — здоровую копию целевого гена, экспрессию полноценного белка, восстановление каскада факторов свертываемости и процессов коагуляции. Такие подходы генетической терапии сейчас активно развиваются.
…который не так прост
Однако у генотерапий на основе аденоассоциированных вирусных векторов есть ряд ограничений. Как мы уже поняли, в препарате генной терапии есть такие компоненты, как вирусный вектор и генетическая конструкция, которая доставляется в организм. Она состоит из последовательности самого гена плюс регуляторные элементы.
Сейчас все виды терапии, которые вышли на рынки (а их на данный момент три), сделаны на основе природных серотипов аденоассоциированных вирусов, то есть используется капсид от природного аденоассоциированного вируса.
Это не очень хорошо, и вот почему: человек регулярно встречается с аденоассоциированными вирусами на протяжении всей жизни. При заражении ими как такового патологического процесса нет, но у людей вырабатывается к ним иммунитет, и после встречи с этими вирусами у них присутствует определенный уровень нейтрализующих антител.
Соответственно, если человек, который ранее встречался с аденоассоциированным вирусом, оказался пациентом, которому необходима генная терапия, то этот препарат в организме человека нейтрализуется антителами, и эффективность лечения существенно снижается. Если у пациента уровень нейтрализующих антител превышает определенное пороговое значение, ему попросту отказывают в лечении генотерапевтическим препаратом.
Еще одна проблема в использовании аденоассоциированных вирусных векторов связана с широкой тропностью природных серотипов — способностью заражать большое количество различных клеточных типов и тканей. Мы уже говорили, что широкая тропность природных серотипов этих векторов скорее плюс — мы можем использовать эти векторы для доставки генов в разные органы и разрабатывать терапии для огромного количества наследственных заболеваний.
Однако это же свойство природных аденоассоциированных векторов одновременно их недостаток. Когда мы доставляем пациенту определенное количество вирусных векторов, они распределяются по организму и попадают не только в целевой орган (в случае гемофилии это печень), но и в другие органы. Из-за этого снижается количество векторов, доставивших препарат в целевой орган. Приходится повышать дозу препарата, что может приводить и приводит к усилению побочных эффектов терапии.
Что делать?
С описанными недостатками природных серотипов аденоассоциированных векторов можно бороться, что достаточно успешно делается в нашем Центре живых систем.
Одна из задач центра — создание искусственных или синтетических капсидов аденоассоциированных векторов, состоящих из частей природных серотипов. Созданные синтетические векторы имеют такой же функционал, умеют так же доставлять в клетки генетический материал, но их структура отличается от природной, поэтому нейтрализующими антителами они не узнаются. Таким образом мы решаем проблему, когда часть пациентов не могут получить генную терапию.
Кроме этого, коллективу центра удалось получить искусственные аденоассоциированные векторы с узкой тропностью к определенным типам клеток. Так, уже получены векторы, специфично заражающие определенные типы клеток сетчатки. Идет работа над синтетическими векторами, специфичными печени.
Сейчас у нас есть пул синтетических векторов, и мы определяем их тропность — к каким тканям они могут быть использованы, в каких терапиях применены. Определяем, способны ли антитела против природных серотипов нейтрализовать полученные синтетические векторы. Проводим их характеристику и видим, что векторы не нейтрализуются антителами, присутствующими у людей. Иначе говоря, мы создали работающие векторы, которые в случае удачного тестирования можно будет использовать в качестве принципиально новой терапии.
Когда появится лекарство?
Мы разрабатываем лекарство для гемофилии В — наиболее распространенной ее формы. Для гемофилии А тоже разрабатываются генотерапии, но с ней сложнее: кодирующий фактор VII достаточно большой и его невозможно запаковать в ААВ-вектор. Требуется оптимизация гена — создание микрогена, меньшего по размеру, но сохраняющего свою функциональность. Это требует дополнительной проработки, и мы тоже планируем этим заняться в дальнейшем.
Кроме разработки синтетических векторов в качестве систем доставки, сотрудники центра работают над созданием синтетических регуляторных элементов генно-инженерных конструкций, используемых в генных терапиях. Так, например, создаются синтетические промоторы, которые не кодируют сам ген, но необходимы для его экспрессии. При этом мы можем минимизировать размер этой части генетической конструкции. Емкость аденоассоциированных векторов не очень велика — около 4500 оснований (или букв ДНК), и уменьшение размера регуляторных элементов очень важно.
Встает сакраментальный вопрос: когда же пациенты получат этот препарат? В среднем разработка генной терапии состоит из четырех принципиальных этапов: ранняя разработка, когда мы собираем генно-инженерную конструкцию, проверяем эффективность экспрессии целевого гена на клеточных и животных моделях, подбираем серотип вектора, который будем использовать для доставки функциональной копии гена. Кроме этого, на этапе ранней разработки необходимо разработать методики, с помощью которых будем определять, эффективна ли наша терапия.
Мы должны уметь определять, насколько эффективно экспрессируется доставленный ген, различными молекулярными методами мы должны показать, что после инъекции препарата появляется целевой белок, в нашем случае девятый фактор свертываемости. Мы также должны уметь показывать, что восстанавливаются утраченные из-за болезни функции.
Дальше — проверка концепции: проводятся эксперименты на модельных объектах, моделирующих патологический процесс. В нашем случае мышка с мутацией в гене F9. Соответственно, проверка концепции состоит в том, что мы пробуем лечить эту мышку, доставляя свой препарат. Мы должны увидеть, что без лечения у мышки проявляется вся симптоматика гемофилии, а после лечения кровь сворачивается на удовлетворительном уровне.
Такая проверка занимает порядка трех лет. После завершения этого этапа проводятся доклинические испытания, когда, помимо эффективности, мы исследуем безопасность. Это примерно два года, после чего при успешном исходе препарат выходит на стадию клинических испытаний — на людях.
В России, кроме нас, есть другие группы, работающие над созданием генотерапевтического препарата от гемофилии В. Основное отличие и преимущество разрабатываемого нами препарата состоит в использовании более высокотехнологичных инновационных подходов синтетической биологии. Мы тут не единственные в мире, но мировые фармацевтические компании, которые занимаются генотерапевтическими препаратами, движутся именно в направлении создания синтетических векторов для генетических конструкций.