Жизненно важные исправления в тексте из трех миллиардов «букв»

Генетики уже несколько лет умеют редактировать поломки в ДНК. Именно поломки служат причиной всех заболеваний и даже процесса старения организма. Методы генной инженерии, успешно внедренные в практику, внушили мировому научному сообществу огромный оптимизм. За технологию редактирования генома в 2020 году была присвоена Нобелевская премия. Что сегодня говорят об этой уникальной технологии будущего ведущие ученые в этой области?

В любой живой клетке есть ДНК с одинаковым кодом для одного организма. Клетки в организме меняются, а ДНК постоянно копируется, и последовательность букв в геноме должна оставаться неизменной, чтобы вся живая система, например человек, продолжала существовать. Но копирование последовательностей 3 млрд букв примерно в 10 трлн клеток человеческого организма не может происходить без ошибок.

В клетках работают системы, состоящие из белков, которые исправляют ошибки и повреждения в ДНК, сохраняя, таким образом, стабильность генома. В каждой клетке нашего организма всего за одни сутки механизмы репарации ДНК успешно исправляют до миллиона повреждений ДНК. Но, к сожалению, достаточно лишь одной неисправленной ошибки, которая пойдет «в тираж», чтобы положить начало серьезному заболеванию. Вот почему ключевая тема биомедицины во всем мире — это механизмы репарации ДНК и их регуляция, повышающие точность и эффективность их работы.

Мечта о голом землекопе

ДНК может повреждаться под воздействием радиации или УФ-облучения, а также под влиянием других оксидативных (окислительных) стрессов, например химических препаратов, инфекций, плохой экологии и других мутагенных факторов окружающей среды. В обмене веществ человека образуются свободные химически активные радикалы, которые также влияют на структуру ДНК. При этом образуются либо одинарные, либо двойные разрывы цепочки ДНК.

Но в любой живой клетке есть свои очень эффективные системы — белки и ферменты — для репарации (починки) ДНК, которые обнаруживают разрывы и сшивают концы ДНК. Когда ДНК повреждена, клеточный цикл останавливается и запускается система репарации. И в этот момент очень важно, чтобы при соединении концов не произошел сбой и в разрыв не было ошибочно вставлено нечто, отличающееся от правильной последовательности данного участка цепи.

Неправильная работа ДНК-полимераз считается наиболее частой причиной мутаций по сравнению с другими факторами. Если ошибку исправить не удается, включается программа уничтожения бракованной ДНК, чтобы она не могла копироваться и создавать испорченные копии, наличие которых может привести к онкологическим заболеваниям. Сейчас во всем мире очень активно изучается, какие именно ферменты и белковые факторы и узнают, и с большей активностью и эффективностью чинят какие-то типы разрывов цепи ДНК.

В Институте химической биологии и фундаментальной медицины (ИХБФМ) СО РАН в лаборатории биоорганической химии ферментов под руководством доктора биологических наук, заведующей лабораторией академика РАН Ольги Лаврик провели сравнение эффективности работы систем репарации в клетках голого землекопа и обычной мыши, и было установлено, что процессы репарации ДНК происходят эффективно у голого землекопа. Его продолжительность жизни составляет около 30 лет, а у его родственника обычной мыши — три года. Кроме того, ученые обнаружили, что голые землекопы практически не болеют онкозаболеваниями. Единственная причина их долголетия и здоровья — в отличной способности эффективно репарировать поврежденную ДНК. Если бы человек мог достигнуть таких способностей репарации, как у голого землекопа, он мог бы жить около восьмисот лет, подсчитали ученые.

Репарация клеточной ДНК в организме происходит постоянно. Но что можно сделать, если что-то вдруг пошло не по сценарию? Этим вопросом генетики разных стран задаются не одно десятилетие. Найти и поправить опечатки в геноме оказалось не так просто. Науке ХХI века до сих пор не хватает для этого нужных знаний механизмов. Методы генной инженерии запрещены в качестве терапии. Обнадеживающая технология направленного редактирования генома была заимствована у бактерий. Они использовали этот механизм для борьбы с вирусами.

Эту технологию биологи назвали CRISPR-Cas, или «молекулярные ножницы», и сейчас пытаются использовать этот подход для направленного редактирования геномов, например для лечения наследственных заболеваний. Первые годы генетики при помощи данной технологии создавали модельные отрезки ДНК с различными патологиями, чтобы разрабатывать способы их исправления. Но сегодня можно уверенно сказать, что некоторые наследственные моногенные (нарушения в одном гене) заболевания, такие как врожденная слепота или муковисцидоз, хорошо поддаются лечению по этой методике. Геномная медицина сегодня становится уже доступным подходом. Так что совсем не обязательно родиться голым землекопом.

Молекулярные ножницы: семь раз отмерь

Дословный перевод аббревиатуры CRISPR — короткие палиндромные повторы, расположенные группами. Эти коротенькие одинаковые отрезки ДНК у кишечных бактерий японские ученые обнаружили еще в конце 1980-х годов, однако не придали им особого значения. Но в помощь науке на рубеже тысячелетий появилась биоинформатика, и анализ геномов заметно ускорился. Выяснилось, что разделительные отрезки между одинаковыми последовательностями (спейсеры) — это чужеродный генетический материал, который бактерии заимствуют при контакте с бактериофагами, призванными их уничтожить.

Вместо того чтобы погибнуть при встрече с вирусом, бактерии заимствуют отрезки его ДНК, а при следующем контакте быстро узнают и уничтожают его при помощи специфичных белков. Этот метод также называют системой адаптивного иммунитета, или CRISPR-Cas. Cas — это бактериальный белок, который в этой технологии служит главным инструментом. Узнавание отрезка происходит через матричную РНК, точнее, ее небольшой отрезок. То есть если создать точную копию неправильной последовательности в виде отрезка РНК и внедрить в клетку пациента, то отрезок нуклеиновой кислоты узнает ошибку, а белок Cas — вырежет ее из ДНК.

Метод взяли на вооружение генетики, поскольку бактериальная система узнавания вирусов не специфична и может узнавать не только ДНК вирусов, но и любые другие отрезки, которые они «запомнили». Если перенести всю эту систему бактериальной защиты в клетку человека или животного, она может работать на узнавание неправильных последовательностей, разрезание и уничтожение неправильного отрезка ДНК. Получается, что при необходимости можно разрезать и склеить любую часть генома человека, животного или растения. Главное достоинство этой системы, как считалось, в ее прецизионной точности.

Однако через несколько лет после всеобщей эйфории ученые выяснили, что кроме точных разрезов в неправильных местах ДНК, которые нужно уничтожить, белок нередко наносит разрезы и в правильных местах. Ведь эти правильные отрезки зачастую отличаются всего на одну букву, и периодически система узнавания ошибается. Причем чем менее уникальна последовательность, тем больше вероятность системной ошибки. Например, бывают последовательности практически из повтора одной и той же буквы с редкими периодическими включениями второй буквы. Такие монотонные отрезки данная методика скорее испортит, чем исправит.

В жизни все иначе, чем в пробирке

«Как всякий новый метод, CRISPR-Cas обладает своими особенностями и сложностями, которые еще предстоит разрешить. Данный метод вызвал волну оптимизма и больших надежд на самые ближайшие успехи в этой области, но очень скоро стало ясно, что не все так просто,— считает академик Ольга Лаврик.— Серьезным барьером при реализации данной технологии по-прежнему остается доставка этих веществ непосредственно в больные клетки пациента через клеточные мембраны, которые не так-то просто преодолеть».

«Если речь о лабораторных экспериментах, когда нет вопроса безопасности для пациента, как в нашем случае, то в клетку вводят плазмиды (небольшие кольцевые ДНК), на которых закодирован белок Cas9 и нужная направляющая РНК,— поясняет заведующий лабораторией геномной и белковой инженерии ИХБФМ СО РАН, доктор биологических наук, член-корреспондент РАН Дмитрий Жарков.— Методов ввести в клетку плазмиды существует довольно много. Если же берутся клетки из пациента и стоит цель изменить их геном и пересадить обратно пациенту (например, костный мозг), то для этого используют два варианта. Можно заранее смешать белок Cas9 и направляющую РНК и ввести их в специальные частицы-липосомы, которые сливаются с клеткой. А можно сделать специальный безопасный для человека вирус, который производит Cas9 и РНК, и ввести его в клетки. Специалистам, перед которыми стоит медицинская задача менять геном клеток внутри пациента, подходит только вирус».

Ферменты репарации ДНК находятся в ядре клеток и являются ключевыми факторами существования всех живых существ на земле. В международном научном сообществе эта тема вызывает огромный интерес, и в ее исследованиях задействовано множество лабораторий в ведущих научных центрах, отметила академик Ольга Лаврик. Сегодня во многих случаях уже можно определить, к каким заболеваниям приводят мутации в конкретных белках. Но технология геномного редактирования CRISPR-Cas9 требует фундаментальных исследований и понимания, каким образом система геномного редактирования кооперируется в клетке с другими механизмами, узнающими разрывы в ДНК. Нужно понимать, как происходит взаимодействие или конкуренция «молекулярных ножниц» с естественными системами репарации ДНК в клетках. Не в клеточных культурах in vitro в пробирке, а в клетках живого организма — in vivo. Очень часто в реальной жизни все выглядит иначе, чем в пробирке.

Применение генной терапии на практике

Большая часть работ с системой CRISPR-Cas во всем мире связана с невероятно широкими научными возможностями — созданием любых лабораторных моделей и изучением различных взаимодействий, которыми можно управлять и корректировать их. Для мировой науки это в первую очередь метод исследования, идеальный инструмент, чтобы спрогнозировать, а затем и спроектировать развитие каких-то процессов в живых системах. Тем не менее несколько новых методов генной терапии сегодня уже доступны пациентам. Первой генной терапией стал препарат voretigene neparvovec (Luxterna). Он одобрен для лечения дистрофии сетчатки глаза, связанной с мутациями гена RPE65. Еще одно лекарство против СМА-1 (спинально-мышечной атрофии первого типа) на основе метода CRISP-Cas называлось Zolgensma. Оно также доказало свою высокую эффективность при лечении новорожденных.

Большие успехи ожидают от данной методики в лечении гематологических заболеваний — серповидноклеточной анемии и талассемии. Заканчиваются клинические испытания препаратов, которые «вырезают» дефектный гемоглобин S и встраивают в ДНК «правильный» гемоглобин. При этом редактирование происходило in vitro: у людей забирали часть стволовых клеток крови, редактировали их при помощи системы CRISPR/Cas9, размножали и вводили пациентам обратно. За полтора года удалось добиться повышения гемоглобина у десятков пациентов с этими диагнозами в полтора раза, в связи с чем они смогли прекратить терапию переливанием эритроцитов и отказались от обезболивающих препаратов. В 2020 году генная терапия против гемофилии была официально признана эффективной.

В терапии онкологических заболеваний методом CRISPR-Cas пока идут клинические испытания первой и второй фазы, при этом технология демонстрирует как положительный, так и нулевой эффект. Биологи и онкологи США изучили мутации в раковых клетках пациентов и каждому разработали уникальный и безопасный препарат — специальные антигены, которые не вырабатываются в клетках пациента. На эти работы ушло девять месяцев. Исследователи сообщили в своей статье в Nature, что из 16 пациентов, прошедших первую фазу испытаний препарата на основе Т-лимфоцитов с антигенспецифичными рецепторами, заболевание стабилизировалось (перестало развиваться) только у пяти, а у остальных прогресс продолжился.

Кроме того, CRISPR используется в экспериментальных целях по уничтожению ВИЧ. К настоящему времени уже три пациента подверглись генетическому редактированию, чтобы вылечить ВИЧ. Результаты пока неизвестны. Пациенты в исследовании принимали антиретровирусные препараты, но план заключался в том, чтобы врачи прекратили прием этих препаратов через 12 недель после лечения генным редактированием и посмотрели, восстановится ли вирус или нет,— шаг, известный как «прерывание аналитического лечения». Если вирус не вернулся, это может означать, что CRISPR уничтожил вирусные гены. В клинических экспериментах на животных процент мышей, которых удалось излечить от ВИЧ с помощью геномного редактирования, составил 40%.

Сегодня, безусловно, рано подводить итоги по методике, которая появилась как инструмент в руках человека всего десять лет назад, а до этого он развивался у бактерий миллиарды лет, причем эффективно работал только против вирусов, поскольку других врагов у бактерий не было. Скептически настроенным ученым необходимо помнить, что человек позаимствовал методику как маленький технический прием, но пытается расширить его до целого огромного направления генной инженерии, которое имеет все шансы стать успешным уже в нашем столетии. Миллиарды лет ждать не придется.

Мария Роговая